IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) د β-galactosidase substrate یو انالوګ دی، کوم چې په لوړه کچه د نه منلو وړ دی.د IPTG د انډکشن لاندې، inducer کولی شي د ریپریسر پروټین سره یو کمپلیکس جوړ کړي، ترڅو د ریپرسر پروټین جوړښت بدل شي، ترڅو دا د هدف جین سره یوځای نشي، او هدف جین په اغیزمنه توګه څرګندیږي.نو څنګه باید د تجربې په جریان کې د IPTG غلظت وټاکل شي؟آیا لوی دی ښه دی؟
لومړی، راځئ چې د IPTG انډکشن اصول درک کړو: د E. coli lactose operon (عنصر) درې ساختماني جینونه لري، Z،Y، او A، چې په ترتیب سره β-galactosidase، permease، او acetyltransferase انکوډ کوي.lacZ hydrolyzes lactose په ګلوکوز او galactose، یا allo-lactose کې؛lacY په چاپیریال کې لیکټوز ته اجازه ورکوي چې د حجرو غشا څخه تیریږي او حجرې ته ننوځي؛lacA د اسیتیل ګروپ د اسیتیل-CoA څخه β-galactoside ته لیږدوي، کوم چې د زهرجن اغیز لرې کول شامل دي.برسېره پردې، یو عملیاتي ترتیب O، د پیل ترتیب P او یو تنظیمي جین I شتون لري. د I جین کوډ یو ریپریسر پروټین دی چې کولی شي د آپریټر ترتیب O موقعیت پورې تړلی وي، نو د اپیرون (میټا) جبران کیږي او بند شود کیټابولیک جین فعال کونکي پروټین-CAP پابند سایټ لپاره د پیل شوي ترتیب P پورته جریان لپاره یو پابند سایټ هم شتون لري. د P ترتیب ، O ترتیب او د CAP پابند سایټ یوځای د لاک اوپیرون تنظیمي سیمه تشکیلوي.د دریو انزایمونو کوډ کولو جینونه د ورته تنظیم کونکي سیمې لخوا تنظیم شوي ترڅو د جین محصولاتو همغږي څرګندونه ترلاسه کړي.
د لاکتوز په نشتوالي کې، لاک اوپیرون (میټا) د جبران په حالت کې دی.په دې وخت کې، د PI پروموټر ترتیب د کنټرول لاندې د I ترتیب لخوا څرګند شوی لاک ریپریسر د O ترتیب سره تړلی دی، کوم چې د RNA پولیمیریز د P ترتیب سره د تړل کیدو مخه نیسي او د لیږد پیل مخه نیسي؛کله چې لیکتوز موجود وي، لاک اوپیرون (میټا) په دې اوپیرون (میټا) سیسټم کې هڅول کیدی شي، اصلي محرک پخپله لیکتوز نه دی.لاکتوز حجرې ته ننوځي او د β-galactosidase په واسطه کټالیز کیږي ترڅو په ایلولیکټوز بدل شي.وروستنۍ، د انډیسر مالیکول په توګه، د ریپرسر پروټین سره تړل کیږي او د پروټین جوړښت بدلوي، کوم چې د O ترتیب او لیږد څخه د ریپرسر پروټین جلا کولو المل کیږي.Isopropylthiogalactoside (IPTG) د allolactose په څیر ورته تاثیر لري.دا یو خورا پیاوړی محرک دی، کوم چې د باکتریا لخوا میټابولیز نه دی او خورا باثباته دی، نو دا په پراخه کچه په لابراتوارونو کې کارول کیږي.
څنګه کولای شو چی د IPTG مطلوب غلظت معلوم کړي؟د مثال په توګه ای کولی واخلئ.
د E. coli BL21 په جنیټیکي ډول انجینر شوی فشار چې مثبت recombinant pGEX (CGRP/msCT) لري په LB مایع متوسطه کې چې 50μg·mL-1 Amp لري، او د شپې په 37 درجو کې کرل شوی.پورتني کلتور د 50mL تازه LB مایع مایع په 10 بوتلونو کې د توسع کولو کلتور لپاره د 1:100 په تناسب کې 50μg·mL-1 Amp لري، او کله چې د OD600 ارزښت 0.6 ~ 0.8 و، IPTG په وروستي غلظت کې اضافه شو.دا 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5، 0.6، 0.7، 0.8، 0.9، 1.0mmol·L-1 دی.په ورته تودوخې او ورته وخت کې د شاملولو وروسته، د باکتریا محلول 1 ملی لیتر له هغې څخه اخیستل شوی، او د بکتیریا حجرې د سینټرفیوګریشن په واسطه راټول شوي او د SDS-PAGE تابع شوي ترڅو د پروټین په بیان کې د مختلف IPTG غلظت اغیزې تحلیل کړي، او بیا د لوی پروټین بیان سره د IPTG غلظت غوره کړئ.
د تجربو وروسته، دا به معلومه شي چې د IPTG غلظت د امکان تر حده لوی نه دی.دا ځکه چې IPTG باکتریا ته یو مشخص زهرجن لري.د غلظت څخه ډیر کول به حجره وژني؛او په عموم کې، موږ هیله لرو چې په حجره کې د حل وړ پروټین څرګند شي، ښه، مګر په ډیری مواردو کې کله چې د IPTG غلظت خورا لوړ وي، د شمولیت لوی مقدار به رامینځته شي.بدن، مګر د محلول پروټین مقدار کم شوی.له همدې امله، د IPTG خورا مناسب غلظت اکثرا لوی نه وي ښه ، مګر ټیټ غلظت.
د جینیکي پلوه انجینر شوي فشارونو د شاملولو او کښت کولو هدف د هدف شوي پروټین حاصل ډیرول او لګښتونه کمول دي.د هدف جین څرګندونه نه یوازې د فشار د خپل فکتورونو او د پلازمیډ څرګندولو لخوا اغیزمن کیږي ، بلکه د نورو بهرني شرایطو لخوا هم اغیزه کوي لکه د انډسر غلظت ، د تودوخې درجه او د انډکشن وخت.له همدې امله، په عموم کې، مخکې له دې چې نامعلوم پروټین څرګند شي او پاک شي، دا غوره ده چې د انډکشن وخت، تودوخې او د IPTG غلظت مطالعه کړئ ترڅو مناسب شرایط وټاکئ او غوره تجربې پایلې ترلاسه کړئ.
د پوسټ وخت: دسمبر-31-2021