IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) د β-galactosidase سبسټریټ یو انالوګ دی، کوم چې خورا انډیکیبل دی. د IPTG د انډکشن لاندې، انډیکیور کولی شي د ریپریسر پروټین سره یو پیچلی جوړ کړي، ترڅو د ریپریسر پروټین جوړښت بدل شي، نو دا د هدف جین سره یوځای نشي، او د هدف جین په مؤثره توګه څرګند شي. نو د تجربې په جریان کې د IPTG غلظت څنګه باید وټاکل شي؟ ایا لوی څومره ښه دی؟
لومړی، راځئ چې د IPTG انډکشن اصل درک کړو: د E. coli د لیکتوز اوپرون (عنصر) درې ساختماني جینونه لري، Z، Y، او A، کوم چې په ترتیب سره β-galactosidase، permease، او acetyltransferase کوډ کوي. lacZ لیکتوز هایدروولیز کوي ګلوکوز او ګالکټوز، یا اللو-لاکټوز ته؛ lacY په چاپیریال کې لیکتوز ته اجازه ورکوي چې د حجرو غشا څخه تیر شي او حجرو ته ننوځي؛ lacA د اسیتیل ګروپ د اسیتیل-CoA څخه β-galactoside ته لیږدوي، چې د زهرجن اغیز لرې کول پکې شامل دي. سربیره پردې، یو عملیاتي ترتیب O، د پیل کولو ترتیب P او یو تنظیمي جین I شتون لري. د I جین کوډ یو فشار ورکوونکی پروټین دی چې کولی شي د آپریټر ترتیب O موقعیت سره وصل شي، ترڅو اوپرون (میټا) فشار شي او بند شي. د پیل کولو ترتیب P پورته د کیټابولیک جین فعالونکي پروټین-CAP تړلو سایټ لپاره د تړلو سایټ هم شتون لري. د P ترتیب، O ترتیب او CAP تړلو سایټ یوځای د لاک اوپرون تنظیمي سیمه جوړوي. د دریو انزایمونو کوډینګ جینونه د ورته تنظیمي سیمې لخوا تنظیم کیږي ترڅو د جین محصولاتو همغږي څرګندونه ترلاسه کړي.
د لیکتوز په نشتوالي کې، لاک اوپیرون (میټا) د فشار په حالت کې دی. پدې وخت کې، د لاک اوپیرون چې د I ترتیب لخوا څرګند شوی د PI پروموټر ترتیب تر کنټرول لاندې د O ترتیب سره تړل کیږي، کوم چې د RNA پولیمریز د P ترتیب سره تړل کیدو مخه نیسي او د ټرانسکرپشن پیل مخه نیسي؛ کله چې لیکتوز شتون ولري، لاک اوپیرون (میټا) هڅول کیدی شي. پدې اوپرون (میټا) سیسټم کې، اصلي انډیوسر پخپله لیکتوز نه دی. لیکتوز حجرو ته ننوځي او د β-galactosidase لخوا کتلیز کیږي ترڅو په ایلولاکټوز بدل شي. وروستی، د انډیوسر مالیکول په توګه، د ریپریسر پروټین سره تړل کیږي او د پروټین جوړښت بدلوي، کوم چې د O ترتیب او ټرانسکرپشن څخه د ریپریسر پروټین جلا کیدو لامل کیږي. اسوپروپیلتیوګالیکټوسایډ (IPTG) د ایلولاکټوز په څیر ورته اغیزه لري. دا یو ډیر پیاوړی انډیوسر دی، کوم چې د باکتریا لخوا میټابولیز شوی نه دی او خورا مستحکم دی، نو دا په پراخه کچه په لابراتوارونو کې کارول کیږي.
د IPTG غوره غلظت څنګه معلوم کړو؟ د مثال په توګه E. coli واخلئ.
د E. coli BL21 جینیاتي پلوه انجینر شوی سټرین چې مثبت بیا ترکیب کونکی pGEX (CGRP/msCT) لري د LB مایع میډیم کې چې 50μg·mL-1 Amp لري واکسین شوی و، او د شپې په 37 درجو سانتی ګراد کې کلتور شوی و. پورته کلتور د 1:100 په تناسب د 50mL تازه LB مایع میډیم کې چې 50μg·mL-1 Amp لري د توسیع کلتور لپاره په 10 بوتلونو کې واکسین شوی و، او کله چې د OD600 ارزښت 0.6~0.8 و، IPTG په وروستي غلظت کې اضافه شو. دا 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5، 0.6، 0.7، 0.8، 0.9، 1.0mmol·L-1 دی. په ورته تودوخې او ورته وخت کې د انډکشن وروسته، د باکتریا محلول 1 ملی لیتر له هغې څخه واخیستل شو، او د باکتریا حجرې د سینټرفیوګیشن په واسطه راټولې شوې او د SDS-PAGE تابع شوې ترڅو د پروټین په څرګندولو باندې د مختلف IPTG غلظت اغیز تحلیل کړي، او بیا د IPTG غلظت غوره کړي چې ترټولو لوی پروټین څرګندونه لري.
د تجربو وروسته به معلومه شي چې د IPTG غلظت هغومره لوی نه دی. دا ځکه چې IPTG د باکتریا لپاره یو څه زهرجنیت لري. د غلظت څخه ډیریدل به حجره هم ووژني؛ او په عمومي ډول، موږ هیله لرو چې په حجره کې څومره محلول پروټین څرګند شي، هغومره ښه وي، مګر په ډیری مواردو کې کله چې د IPTG غلظت ډیر لوړ وي، د شمولیت لویه اندازه به رامینځته شي. بدن، مګر د محلول پروټین مقدار کم شوی. له همدې امله، د IPTG ترټولو مناسب غلظت اکثرا لوی نه وي، مګر غلظت ټیټ وي.
د جینیاتي پلوه انجینر شوي سټرینونو د انډکشن او کښت موخه د هدف پروټین حاصل زیاتول او لګښتونه کمول دي. د هدف جین څرګندونه نه یوازې د سټرین د خپلو فکتورونو او د بیان پلازمیډ لخوا اغیزمن کیږي، بلکې د نورو بهرنیو شرایطو لخوا هم اغیزمن کیږي، لکه د انډکشن کونکي غلظت، د انډکشن تودوخې او د انډکشن وخت. له همدې امله، په عمومي توګه، مخکې له دې چې یو نامعلوم پروټین څرګند او پاک شي، غوره ده چې د انډکشن وخت، تودوخې او IPTG غلظت مطالعه کړئ ترڅو مناسب شرایط غوره کړئ او غوره تجربوي پایلې ترلاسه کړئ.
د پوسټ وخت: دسمبر-۳۱-۲۰۲۱